جداسازی، همسانه‎سازی و بیان دو ژن کدکننده تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به nadphاز گیاه برنج ( oryza sativa)

سیستم nadp- تیوردوکسین متشکل از nadph، nadp- تیوردوکسن ردوکتاز (ntr) و تیوردوکسین h (trx h)است که با احیا باندهای دی‎سولفیدی پروتئین های هدف شرکت کننده در فرآیندهای مختلف سلولی، نقش مهمی را در سلول ایفا می کند. مولکول‎های trx زمانی که از طریق nadph به وسیله تیوردوکسین ردوکتاز به فرم احیا درمی آیند، به عنوان فاکتورهای رشد سلولی عمل کرده و از فرآیند مرگ سلولی برنامه‎ریزی شده، جلوگیری می کنند. با احیاء ریبونوکلئوتیدها به دی اکسی ریبونوکلئوتید ها، در سنتز dna دخالت دارند و با تاثیر بر فاکتورهای رو نویسی، در بیان ژن اثر می‎گذارند. با احیاء تیو ردوکسین پراکسیداز‎ ها منجر به شکسته شدن مولکول 2o2h به مولکولo 2h شده و در نتیجه به عنوان آنتی اکسیدان عمل می?کنند. سیستم h ntr/trx در گیاهان به دلیل وجود ایزوفرم های چندگانه از ntr وh trx در مقایسه با پروکاریوت‎ها و جانوران، پیچیده تر است. بدین ترتیب سوالی در رابطه با میزان اختصاصی بودن عمل هر یک از ایزوفرم های ntr در واکنش با ایزوفرم های trx h مطرح می‎گردد. با جستجو در پایگاه ژنومی برنج (oryza sativa)، نه ژن کدکننده برای trx h و چهار ژن کدکننده برای ntr شناسایی شد. هدف از این تحقیق، تولید فرم‎های نوترکیب خالص از ntrهای گیاه برنج است که ما را به بررسی روابط متقابل میان ایزوفرم‎های مختلف ntr و ایزوفرم‎های trx h از گیاه برنج و ارگانیسم‎های دیگر، قادر خواهد ساخت. ‎‎در این تحقیق به شرح جداسازی، همسانه سازی، بیان، خالص‎سازی و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی دو توالی کامل cdna کد کننده دو ntr برنج به نام های osntr1 و osntr2 پرداخته ‎شده‎ است. پلی پپتیدهای حاصل از این توالی کدکننده، شباهت بالایی را به ntrهای نوع سیتوزولی و میتوکندریایی گیاهی (a/b ntr) نشان می دهند که دارای دومین متصل به fad، nadp و جایگاه فعال در ساختار خود هستند. در تحقیق حاضر، توالی کدکننده osntr1 با استخراج rna از بافت ساقه هفت روزه وانجام rt-pcrجداسازی گشت و در پلاسمید blunt pjet1/2 همسانه سازی شد. از آنجا که بیان osntr2 در بافت‎های هفت روزه برنج تایید نگردید، توالی کدکننده osntr2 توسط شرکت genescript سنتز و در پلاسمید puc57 قرارگرفت. با توجه به این‎که، جایگاه های برشی ecor i و hind iii در دو طرف توالی کدکننده osntr1 و osntr2 تعبیه شده بود، پس از برش قطعات orf با این آنزیم های برشی ، این قطعات در ناقل بیانی pet28a همسانه سازی شدند. توالی ها پس از این که از طریق توالی یابی مورد تایید قرارگرفتند، به میزبان بیانی rosetta (de3) ( سویه ای از باکتری e.coli) منتقل شدند و به منظور تولید پروتئین های نوترکیب با iptg القا گشتند. بیان پروتئین های نوترکیب از طریق sds-page بررسی ‎شد و هریک از پروتئین های نوترکیب osntr1 و osntr2 هم در فاز محلول و هم غیر محلول مشاهده شدند که بخش عمده آن ها در فاز نامحلول قرار می گرفت. از این رو با بهینه سازی شرایط کشت از طریق کاهش دما و کاهش غلظت iptg به کار رفته در محیط کشت، حلالیت پروتئنین های نوترکیب افزایش یافت. در مرحله بعد پروتئین های his6-osntr1 و his6-osntr2 با کمک کروماتوگرافی جذبی بر روی ستون نیکل با موفقیت خالص سازی شدند. پروتئین های خالص شده زرد رنگ و دارای الگوی اسپکتروفوتومتری مشابه با دیگر فلاووپروتئین ها بودند. بدین ترتیب، تولید فرم های نوترکیب خالص در مقیاس بزرگ ازهر دو ایزوفرم osntr1 و osntr2 امکان مقایسه فعالیت کینتیکی این پروتئین ها و همچنین مقایسه برهمکنش آن ها را با فرم های نوترکیب سه ایزوفرم ostrx h از گیاه برنج که به موازات این تحقیق تولید شده اند، در آینده فراهم خواهد ساخت.